TRANSFORMACION GENETICA DE PLANTAS

Transferencia de genes exógenos al interior del genoma vegetal, los cuales previamente han sido modificados in vitro para permitir su expresión mediante un Cassette de expresión donde se ubican genes reporteros, esta construcción es llevada al vector que se emplea como vehículo para transferir las secuencias genómicas al vegetal

La tecnología del DNA Recombinante ofrece la posibilidad de evitar los problemas asociados con el mejoramiento clásico, permitiendo a los genetistas identificar y clonar genes específicos para las características deseables e introducir estos rasgos en las plantas.

Proceso de alteración del genotipo de una célula mediante la introducción de uno o más genes por vía no sexual

Transformación Genética:

•          Transferencia mediada por Agrobacterium t.

•          Transferencia directa: microinyeccion, electrophoracion, biobalistica

Procedimiento

Corte del gen

Colocarlo dentro del vector

Insertar el vector en el genoma objetivo

Evaluación de la expresión en el organismo modificado

Localización del gen

CARACTERISTICAS

·         Se transfiere directamente o indirectamente ADN

·         Los transgenes pueden provenir de diferentes géneros, familias o reinos

·         El pool genético a utilizar es ilimitado

·         Además del gen de interés se transfieren genes marcadores de selección y genes marcadores de detección

REQUISITOS

•          Sistema de regeneración de células blanco

•          Secuencias génicas (estructural y reguladora) necesarias para la expresión

•          Sistema de transformación biológica o física para introducir el o los genes

•          Estrategia de selección de células/plantas transformadas

Genes marcadores

Genes reporteros: Confieren a la célula transformada una característica nueva que la hace distinguible de las no transformadas.

Pueden ser detectados a traves de sus productos de expresion ( enzimas)

Permiten evaluar cualitativa y cuantitativamente  la expresion genica

Gen gus: codifica para β-glucuronidasa

La enzima β-glucuronidasa reacciona con el sustrato NPG el cual al ser hidrolizado se puede cuantificar espectrofotometricamente

La deteccion fluorometrica de GUS emplea como sustrato el MUG en el cual el producto final es fluorescente

La deteccion histoquimica se realiza con el sustrato X-Gluc el cual bajo accion de la enzima produce un precipitado azul

La β-glucuronidasa no tiene efectos negativos sobre el desarrollo y reproduccion de los vegetales, puede ser transportada a traves de las membranas y permite analizar desde celulas aisladas hasta tejidos completos

Marcadores de selección: son aquellos que al ser incorporados en plantas, les confieren resistencia a antibioticos o herbicidas de amplio espectro permitiendo la selección de transformantes

Ya que no existe un gen que de manera uniforme confiera resistencia a la misma sustancia en todas las especies son necesarios marcadores adicionales para repetir la transformacion en individuos transgenicos

Genes marcadores mas utilizados nptII, bar, hpt y sul

Metodos de Transferencia de genes a plantas

Métodos directos                                                               

Electroporacion

Microinyección   

Biobalística                                       

ELECTROPORACIÓN

Es el proceso por el cual las membranas bilipidicas se vuelven permeables en forma reversible, producto de la aplicación de campos electricos de alta intensidad.

Cuando la membrana celular es polarizada por alto voltaje, se forman poros que permiten el intercambio de compuestos entre el medio intra y extracelular, este efecto es transitorio y despues de un lapso de tiempo la impermeabilidad y resistencia de las celulas es reestablecida, el pulso de electroporacion es generado por la descarga de un capacitor a traves de electrodos colocados en una cubeta diseñada para estos fines, en esta son colocados los blancos biologicos  y el ADN plasmidico que porta la informacion genetica que se desea expresar, ambos en un buffer de composicion y conductancia electrica conocidas

Ventajas y desventajas del metodo

  Al comparar la electroporacion con otros metodos directos esta los supera respecto a la mayor facilidad de controlar los factores que influyen positivamente en la obtencion de buenos resultados

  Como principal desventaja se tiene la de necesitar un gran numero de manipulaciones y necesitar gran cantidad de ADN para cada ensayo

BIOBALISTICA

Introduccion directa de acidos nucleicos a celulas intactas, tejidos y organos a traves del disparo de microproyectiles con una pistola de genes 

PARAMETROSA TENER EN CUENTA

Parámetros referidos al acelerador

  La fuente de energía

  El macroproyectil: Forma cilíndrica o circular

  Vacio

  Pantalla dispersora de macroparticulas

 Velocidad del impacto: Presión, recorrido y distancia de ubicación del impacto

 

Parámetros de los microproyectiles

Tipo de microproyectil (tungsteno, oro, platino etc. )

 Tamaño de la partícula

 Recubrimiento de la partícula con el DNA (CaCl2 Y espermidina)

 Ubicación de la partícula en el macroproyectil.

 Parámetros Biológicos

  Estado fisiológico

  Tipo de blanco

  Origen del blanco

  Tamaño del blanco

  Peso molecular y naturaleza (Cadena doble o simple) de la biomolecula

  Ventajas y desventajas

  Es un  metodo de aplicación general

  Intervienen protocolos de trabajo simples y rapidos

  Emplea pequeñas cantidades de ADN y los tejidos blanco pueden ser muy variados no necesitando una preparacion compleja

  El equipamiento es facil de manipular

  Parametros fisicos pueden ser variados a conveniencia

  Es un metodo de menor reproducibilidad

 METODOS INDIRECTOS

  Agrobacterium:

Bacteria Gram-Negativa de la Familia Rhizobiaceae, tiene dos especies de interés A. tumefaciens y A.rhizogenes

TRANSFORMACIÓN MEDIADA POR Agrobacterium

La bacteria del genero Agrobacterium es patógena de plantas causante de la enfermedad conocidacomo Agalla de la corona o tumor en el sitio de la infección, al iniciarse la patogenia en la planta se inducen la produccion de hormonas y opinas, estas ultimas empleadas por la bacteria como fuente de carbono y nitrógeno. Agrobacterium tiene megaplasmidos caracteristicos de entre 140-235 kb, se conocen como plasmidos Ti (induccion de tumor)

Estos plasmidos poseen cuatro regiones principales:

ADN-T: region que se escinde y luego se integra en la celula vegetal, secuencias borde

VIR: region de 35 kb, que codifica para la mayoria de las funciones de virulencia

ORI: origen de replicacion

CON: secuencia que codifica para funciones de conjugacion

200 kb aprox.

Región vir

 T-DNA

Síntesis   de opinas

Figura 6:  Mapa genético de un vector co-integrado

Figura 7:  Transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens

CONFIRMACIÓN DE TRANSFORMACION ESTABLE

Detección de ADN transgen en ADN genómico (Southern)

 Detección de RNAm del transgen (Northern)

 Presencia de la proteína o actividad enzimático (Western)

Estabilidad

Integridad

Numero de copias

Herencia

Nivel de expresion

APLICACIONES EN EL MEJORAMIENTO GENETICO

Resistencia al ataque por insectos

Resistencia a virus

Resistencia a herbicidas

Mejora de la calidad de los frutos

Mejora de la calidad nutricional

Resistencia a hongos patogenos