PROPAGACION MASIVA DE PLANTAS

PROPAGACION MASIVA DE PLANTAS

HISTORIA

¢  Primeros laboratorios comerciales para escalado de producción creados en 1964 en Francia y USA para propagación de flores y ornamentales (BIOFABRICAS)

¢  Determinación de protocolos de desinfección

¢  1990 la producción mundial de plantas clonadas in vitro alcanzaba los 500 millones

¢  Holanda el mayor productor con 60 millones de plantas en ese año

¢  Francia 40, Italia 30, Bélgica 24 y Reino Unido 21 millones

¢  Estados Unidos 250 labs con una capacidad productiva de 150 millones de plantas por año

¢  550 laboratorios comerciales  en Europa, USA, Israel

¢  1993 Europa Occidental 172 laboratorios comerciales  con una producción total de 125 millones de vitroplantas anuales

¢  1994 Polonia y la India pasan a ser los mayores productores gracias a la apertura de grandes laboratorios con una mano de obra a muy bajo costo

EN COLOMBIA

¢  Actualmente existen centros de investigación donde se aplican métodos de micropropagación en diferentes especies, con altas producciones  y alta calidad fitosanitaria

• CENICAFE
• CENICAÑA
• CIAT
• PARQUE TECNOLOGICO DE ANTIOQUIA

• UCO

¢  Posibilidades de las tecnologías desarrolladas

Micropropagacion convencional : meristemos, ápices, yemas   

     

PRIMERA GENERACION

¢  Ha sido aplicada en mas de 50.000 variedades de 1.000 especies de plantas de flores y ornamentales, agrícolas, forestales y especies de uso industrial.

¢  Tecnología relativamente simple, requiere una alta disciplina tecnológica y organizativa, requerimientos de personal capacitado y equipos, posibilita la obtención de altas tasas de multiplicación y aceptable estabilidad genética

Embriogenesis somática   

SEGUNDA GENERACION

¢  La biología y tecnología de este método es mucho mas compleja

¢  Se ha descrito y estudiado la embriogénesis en aproximadamente 200 spp de plantas como zanahoria, alfalfa, café y apio, modelos biológicos

No en todas se ha logrado un escalado 

VENTAJAS DE LA PROPAGACION in vitro

¢  Los cultivos se inician a partir de explantes y posteriormente se propagan los brotes    =

¢  Micropropagacion implica espacio pequeño para un gran numero de plantas

¢  Condiciones asépticas = no se presentan perdidas debidas a enfermedades, plantas libres de patógenos

¢  Control de factores produce una tasa de propagación mayor que métodos convencionales

¢  Mayor numero de plantas en menor tiempo

¢  Clones de especies difíciles de propagar vegetativamente

¢  Independencia de cambios estacionales

¢  El material producido vegetativamente puede almacenarse por largos periodos = bancos de germoplasma

¢  Optimización del espacio en invernadero

¢  Las labores de control de malezas, riego y fumigaciones no son necesarias

¢  DESVENTAJAS

¢  Son necesarias buenas técnicas en el manejo del material

¢  Las instalaciones y equipamientos son costosos

¢  Para algunas especies en particular son necesarios métodos muy específicos

      CONSECUENCIAS

¢  Gran numero de plantas pero tamaño pequeño

¢  Las plántulas obtenidas no son autotróficas – periodo transicional

¢  Variación somaclonal cuando no es lo que se busca

¢  Murashige (1974)  propone estado I, II y III

¢  Actualmente se reconocen 5 fases criticas para lograr una exitosa micropropagacion

ESTADO 0 FASE PREPARATIVA

            Indispensable en el desarrollo de un sistema de micropropagacion eficiente y repetible

 Selección de material elite

• Constitución genética
• Plantas madre con características deseadas
• Estado fisiológico de la planta

¢ Pretratamiento a las plantas  donadoras

• Libres de patógenos y enfermedades

• Diagnostico y saneamiento

Crecimiento de las plantas en ambientes controlados e higiénicos

• El impacto de la fase 0 no esta limitado únicamente al aspecto sanitario de los explantes si no también a la supervivencia de los mismos
• Control de condiciones ambientales: luz, temperatura y humedad relativa

 ESTADO I FASE DE ESTABLECIMIENTO

¢  Cultivo aséptico

¢  Reacción apropiada

¢  Se da por terminada esta fase cuando se logra un adecuado numero de explantes que sobreviven sin contaminación y con crecimiento

¢  Asepsia y viabilidad

¢  Explante:  depende del objetivo

• Genotipo, especies recalcitrantes
• Estado de desarrollo de la planta madre
• Edad fisiológica del explante
• Tamaño

¢  Desinfección del explante

• Fuentes de contaminación
• Tipos de contaminación
• Protocolos de desinfección

            Hipoclorito de sodio (NaClO), Hipoclorito de calcio (CaClO), Peróxido de hidrogeno (H2O2)------Concentraciones de 1 a 3% Tiempos de 10 a 20 min

Etanol                                    al 70%

Bicloruro de mercurio (HgCl2)           0.1% de 1 a 3 min  

Tween 20

Antibióticos

¢  Medios de cultivo

• Medio basal MS con modificaciones
• Balance hormonal

¢  Oxidación fenolica: ennegrecimiento del medio de cultivo, afectación del crecimiento del explante, fitotoxicos

• Antioxidantes

            Acido ascórbico

            Acido cítrico

ESTADO II FASE DE PROLIFERACION

¢  Es la fase mas importante y determinante para el éxito de la propagación

¢  Producción de mayor numero de propagulos

¢  Obtener multiplicación de órganos y estructuras para producir nuevas plantas

¢  Brotes axilares, adventicios, embriones, órganos de almacenamiento en miniatura

            Yemas axilares posibilita la mayor estabilidad genética

¢  Medios de cultivo: White, MS – balance hormonal

• CITOQUININAS: inhibe la dominancia apical generando brotes lateras
• Estado físico del medio

¢  Condiciones del cultivo

¢  Estado sanitario de los explantes y perdidas por contaminación  (mala manipulación)

¢  Numero de subcultivos

• Coeficiente de multiplicación
• Aumento de la frecuencia de aparición de variantes somaclonales, debido a la variación asociada a la formación de yemas adventicias cuya presencia aumenta conforme aumentan los subcultivos
• Cambios genéticos: aneuploidias, poliploidias aumentan a medida que se incrementa el tiempo que permanecen los cultivos in vitro

¢  Renovación de explantes 

ESTADO III FASE DE ENRAIZAMIENTO

¢  Enraizamiento de brotes antes de transferirlos al suelo

¢  Preparación para el crecimiento en ambiente  natural

¢  Tratamiento especial para que las plántulas sean capaces de llevar a cabo su fotosíntesis y sobrevivir sin suministro artificial de CHOS

¢  Medios de cultivo simples y preferiblemente líquidos: permiten difusión de los residuos tóxicos de las vitroplantas (fenoles)

¢  AUXINAS  (ANA)

¢  Luz natural

¢  Rizogenesis

• Iniciación:  [    ] auxinas [    ] citoquininas
• Elongación

¢  Concentración de sales minerales: disminución de sales a la mitad, un tercio o un cuarto

¢  Concentración de sacarosa:   [    ] crecimiento vigoroso de las raíces, mayor sobrevivencia

¢  Intensidad de luz y temperatura: factores de mayor influencia

• Luz: intensidad, duración y calidad
• Temperatura: plantas tropicales o de clima templado
• 
  

ESTADO IV FASE DE TRANSFERENCIA

• Adaptación ex vitro, transferencia al ambiente natural, climatización
• Si no se lleva a cabo cuidadosamente resulta en una gran perdida de material
• Durante el cultivo in vitro las plantas crecen bajo un ambiente con alta humedad relativa, baja intensidad luminosa, temperatura constante, escaso intercambio gaseoso y medios ricos en compuestos orgánicos, estas condiciones provocan cambios en la morfología y la fisiología de las plantas
• Estructuras débiles, tallos delgados
• Reducción de tejidos mecánicos de soporte
• Bajo contenido de cera epicuticular
• Los tejidos de plantas cultivadas in vitro pierden agua rápidamente cuando se transfieren a condiciones externas
• Los cloroplastos no están bien desarrollados, no dependen de su propia fotosíntesis
• Estomas con baja funcionalidad

TECNICAS DE ACLIMATACION

            Están encaminadas a lograr gradualmente menos humedad relativa, mas luz, crecimiento autotrófico y un medio séptico

¢  IN VITRO

• Disminuir la HR hasta niveles similares al ambiente externo
• Destapar los frascos a nivel de invernadero
• Aumentar gradualmente la intensidad luminosa
• Luz natural

¢  EX VITRO

• Control de factores ambientales
• Simular condiciones de ambiente in vitro
• Regulación de la luz para evitar fotoinhibicion del aparato fotosintético
• Fotoperiodo

Instalaciones utilizadas para la aclimatación

¢  Instalaciones utilizadas para la aclimatación

¢  UMBRACULOS

¢  INVERNADEROS

¢  Manejo de las plantas

Alto porcentaje de perdidas si las plantas no están correctamente climatizadas

¢  Sustratos

• Turba                                             
• Humus
• Compost                                                     
• Zeolita

METODOS

PROPAGACION  A  PARTIR DE BROTES AXILARES

¢  Es el método de cultivo mas aplicable, incluye el cultivo de brotes terminales y nudos simples

Brotes terminales o laterales: 

• Aplicado principalmente para micropropagacion comercial
• Explante ápice de tallo lateral o terminal de       5-15mm
• Se remueve la dominancia apical y con la adición de citoquininas se promueve la formación yemas axilares
• Mayor supervivencia por su tamaño
• El crecimiento inicia rápidamente

Cultivo de nudos simples:

• Uno de los métodos de propagación mas sencillos
• Explantes brotes no ramificados que contengan varios nudos separados y definidos, se promueve el brote de yemas axilares
• Acodo in vitro los brotes se colocan en posición horizontal  (papa)
• Se pueden subcultivar los nudos simples

PROPAGACION DE BROTES MULTIPLES A PARTIR DE SEMILLA

¢  Se esteriliza la semilla y se coloca en medio basal con citoquininas, al germinar la semilla crecen agregados de brotes axilares o laterales que pueden dividirse y subcultivarse

¢  Se consiguen altas tasas de multiplicación

¢  Efectivo para herbáceas y leñosas

BROTES A PARTIR DE MERISTEMAS FLORALES

¢  Crecimiento de brotes meristematicos preexistentes que no se originan de yemas axilares

¢  Meristemas que normalmente producen flores se inducen a reversión in vitro hacia brotes vegetativos

¢  Uso de inflorescencias jóvenes

ORGANOGENESIS Y EMBRIOGENESIS

FORMACION DE ORGANOS DE ALMACENAMIENTO

¢  Presentan menos dificultades en su transferencia a condiciones ex vitro reduciéndose e incluso eliminándose la fase de aclimatación

¢  Posibilidad de almacenarlos en condiciones no asépticas

¢  Muchas spp ornamentales y de cultivo se propagan vegetativamente a través de órganos de almacenamiento

¢  Bulbillos

¢  Cormillos

¢  Protocormos

¢  Microtuberculos

          Microrizomas

SEMILLA ARTIFICIAL

¢  1977 Murashige propone regenerar plantas a partir de embriones recubiertos por un endospermo artificial

¢  Fue llevada a la practica por Kitto y col. en 1982 al obtener semillas sintéticas deshidratadas y por Redenbaugh y col. en 1984 al lograr semillas sintéticas hidratadas

¢  Un sistema de propagación por semilla artificial debe ser capaz de producir un volumen elevado de propagulos (embriones encapsulados) y ser suficientemente barato como para poder competir con la semilla sexual

¢  Puede convertirse en un sistema revolucionario de propagación de plantas para muchas spp vegetales

¢  La semilla artificial consta de una capsula (tegumento) que reviste el órgano (brotes, ápices, yemas, meristemas, embriones), el cual puede crecer y convertirse en una planta completa nutriéndose de una lamina artificial interna a manera de endospermo y que contiene los nutrientes requeridos por el embrión para su desarrollo y fitohormonas para el control de la germinación

¢  Semilla artificial hidratada:  tejido encapsulado en un hidrogel como Alginato de Calcio

¢  Semilla artificial deshidratada: tejido desecado recubiertos con resina plástica de polietilenglicol

¢  Aplicación: propagación de plantas de multiplicación vegetativa como caña de azúcar, banano y plantas perennes como forestales y frutales, híbridos y plantas obtenidas por ingeniería genética

¢  Germinación: la germinación puede realizarse en cámaras incubadoras, invernaderos, umbráculos o en campo

           

¢  Automatización de la micropropagacion


BIORREACTORES

Producción de grandes volúmenes de plantas con parámetros ambientales controlados , contacto permanente con el medio de cultivo lo que estimula la absorción de nutrientes y la tasa de crecimiento, la aireación del medio estimula el crecimiento de la biomasa

            El objetivo básico de un biorreactor es proveer las condiciones de crecimiento optimas para las células mediante la regulación  precisa de los factores ambientales

¢  Parametros fisico-quimicos en un biorreactor

¢  Los biorreactores has sido equipados con varios sensores para la medición y control de

Temperatura

      Velocidad del agitador
      pH
     Oxigeno disuelto
     Potencial redox
     Bióxido de carbono