HIBRIDACION SOMATICA Y OBTENCION DE PLANTAS HAPLOIDES

PROTOPLASTO

•          Unidad de protoplasma contenido dentro de una célula

•          Unidad homeostática básica de la célula en la que no esta involucrada la pared celular  (Hanstein)

•          1892 primer reporte de aislamiento y obtención de un protoplasto

Características de los protoplastos

Tienen la capacidad de producir un organismo altamente diferenciado a partir de una sola célula

•       Forma esférica

•      Tienen la capacidad de regenerar la pared celular, multiplicarse  regenerar plantas completas

•        Pueden incorporar macromoleculas, virus, partículas virales

•       Pueden fusionarse entre si, dando origen a híbridos     intergenericos  p.e en maíz y soya

•        Heterocariocitos interespecificos, intergenericos e interreinos

•        Herramienta ideal para inducción de mutaciones y en el cultivo de células vegetales

•    De gran utilidad  en estudios básicos en morfologia, fisiología, hibridación somática, propagación, fitomejoramiento

•     Razones para realizar el cultivo de protoplastos

• En los protoplastos puede inducirse la fusion para producir plantas híbridas, las cuales no pueden ser logradas por métodos convencionales debido a la incompatibilidad

•  Los protoplastos son capaces de ingerir material foráneo dentro del citoplasma, este material incluye:
introducción de núcleo, cloroplastos, mitocondria, DNA, plasmidos, bacteria
y virus.

•          Para estudios de síntesis de pared y deposición

•  Los protoplastos pueden ser estudiados como sistemas celulares Independientes.

•   Han sido aislados a partir de  multiples especies y de casi todas las partes vegetales como raiz, nodulos radiculares, tejido de frutos, pericarpio, petalos florales, tuberculos, endospermo, celulas de mesofilo siendo la mejor fuente de estos las hojas en estado juvenil y con crecimiento activo o las suspensiones celulares

La operación fundamental para el aislamiento de Pp es la remoción de la pared celular sin causar daño al protoplasma

METODO MECANICO: se sumerge el tejido en una solucion hipertonica provocando plasmolisis

Ya plasmolizadas las celulas se secciona el tejido y se liberan los protoplastos

Este metodo evita el daño metabolico causado por el uso de enzimas, pero se obtiene una pequeña cantidad de protoplastos

•          Metodo enzimatico

•          Tratar el tejido con una mezcla de enzimas degradantes de la pared

•          Celulasas, hemicelulasas, pectinasas

p. ej: pectinasa para separar celulas del mesofilo y celulasa para degradar pared celular

•          Se obtiene un mayor numero de Pp

•          Impide que las celulas se rompan

•          Método enzimático, aspectos a considerar

•         

Enzimas:

          Celulasa: Onozuka  R10, Driselasa, Celulisina, Meicelasa

          Hemicelulasa: Rhozima HP 150, Hemicelulasa

          Pectinasa: Macerozima R 10, Macerasa, Pectiolasa Y 23

          Purificación de la enzimas a utilizar

          Medio de incubación: Sales (CaCL2, KH2PO4, MgCl2)

                                             Medio de cultivo

                                             Amortiguador (fosfato, MES)

                                             Estabilizador osmótico (manitol, sorbitol,

                                                      sacarosa, glucosa): 0.3-0.7M

          Ph : 5.0-6.0

•          Duración del tratamiento: Material  Fuente

•           

•          CULTIVO

•          Material de origen de los protoplastos 

     Edad

•          Densidad de la población: 10⁴ – 10⁵  protoplastos/ml

•          Sistemas de Cultivo: líquidos (capas delgadas y gotas)

•                                          y sólidos (mezcla de proto y el medio)

•          Composición de los medios

•                  Sales inorganicas: bajos niveles de sustancias inorgánicas

•                    Estabilizadores osmoticos: sorbitol, manitol, glucosa y sacarosa

•                    Reguladores de crecimiento

•                    Otros componentes: extracto de levadura, caseína hidrolizada

•                                                     a.a., vitaminas, ácidos orgánicos entre otros

•          Tipo de enzimas: mezcla de enzimas

•          Desarrollo del cultivo

•          Regeneración de la pared celular

•          División celular

•          Evaluación de la eficiencia

•           

CARACTERISTICAS DE LOS PROTOPLASTOS AISLADOS

•          Las poblaciones de protoplastos recién aislados refleja las

propiedades Morfológicas y fisiológicas de las células de las cuales

se derivan

            mesofilo: cloroplastos

           

•           Conservan la heterogeneidad del tejido original, pudiendose

Reagruparlos por centrifugación, en gradientes iso-osmoticos de

densidad, o clasificarse por flujo y citometria.

•           Cambios claramente caracterizados en su metabolismo por el

efecto del estrés osmótico, la remoción de la pared celular,

de la ruptura de los plasmodesmos y del ambiente nuevo a que estos

están sometidos.

El choque osmotico ocasiona cambios en el patrón del RNA y síntesis

de proteínas      (Proteínas de choque osmótico)

EFICIENCIA DEL CULTIVO

DENSIDAD DE SIEMBRA

Los Pp tienen un maximo y un minimo de densidad de siembra para el crecimiento

La eficiencia optima de siembra  (para Pp de tabaco) es de 5 x 10⁴ Pp/cm³.

Los Pp no se dividen cuando se siembran a una decima parte de esa concentracion

La concentracion de los protoplastos puede  ser determinada por un hemocitometro Fuchs-Rosenthal modificado con una profindidad de campo de 0,2 mm, es posible ajustar la concentración de protoplastos en el nivel apropiado de dilución o concentración después de la centrifugación

TEST DE VIABILIDAD

Diacetato de fluoresceina
Azul de Evans: la impermeabilidad de la celula al azul de Evans indica que es una celula viva.

 La ciclosis  puede ser una medida de viabilidad

Tasa de supervivencia

TS:  Protoplastos que sobreviven/

Protoplastos totales

Los Pp de mesofilo empiezan a regenerar nueva pared celular a unas pocas horas de su aislamiento, sin embargo puede tomar varios dias completar la biosintesis de la pared

Esto puede ser observado microscopicamente usando Calcofluor blanco, el medio de contraste blanco se une al material de la pared y fluoresce con luz azul

Una vez los Pp han regenerado la pared celular, se empiezan a dividir y a formar callos, estos callos pueden ser subcultivados. El callo puede sufrir embriogenesis u organogenesis despues de 3 a 4 semanas en condiciones de cultivo correctas. Los embrioides/organos crecen de la misma manera como la mayoria de plantulas cultivadas in vitro.  

La posibilidad de regenerar plantas a partir de protoplastos aislados

es relativamente baja. Para el año 1983 solo era posible realizarlo en

Solanaceas: Nicotiana, Petunia, Solanum, Lycopersicum, Atropa, Browallia

                     Capsicum, Datura, Hyoseyamus

Otras Familias: Daucus carota, Manihot esculenta, Medicago sativa, Trifolium

                          repens, Brassica napus, Asparragus officinalis y Citrus sinensis

Las gramíneas (excepto el arroz) son difíciles de regenerar (Potrykus et al., 1983)

Hibridación somática

•          Barreras de incompatibilidad: en el caso del polen no hay compatibilidad de sustancias para romper la exina y formar el tubo polinico

•           La producción de híbridos somáticos anfidiploides (diploides originados por la hibridación de haploides) y fértiles de especies incompatibles

•           Producción de líneas heterocigóticas dentro de una especie que normalmente solo se propaga por vía vegetativa

•           La transferencia de solo una parte de la información nuclear de una especie a otra mediante el fenómeno de eliminación de cromosomica

•           Transferencia de información genética citoplasmática de una línea o especie a otra

•          Fusion de Pp

Actualmente es posible fusionar casi cualquier tipo de Pp

•          Fusion espontanea: puede darse durante la fase de aislamiento, es mas probable cuando el Pp proviene de cultivos celulares con rapida división

                Durante la fase de aislamiento ya que tana pronto la pared es degradada las conexiones de los plasmodesmos entre celulas vecinas se alargan y expanden hasta permitir el paso de organelos completos a la celula adyacente (Pp multinucleados)

FUSION INDUCIDA

AGENTES INDUCTORES

QUIMICOS

•          Sales inorgánicas: nitrato de sodio, en los primeros trabajos

•           Alto contenido de calcio y alto pH (10.5): Keller et al. (1974)

 Los fosfolipidos de membrana tienden a repelerse mutuamente a pH fisiológico. El Ca++ y pH redistribución de cargas y formación de puentes de Ca++                   distorsiones de la membrana y mas adelante fusión

•           Polietilen glicol (PEG) se ha utilizado exitosamente para fusionar diferentes protoplastos vegetales. Propicia agregación adicional

Fusión: en tubos de centrifuga mezclando la solución de PEG

con la suspensión de protoplastos

Electrofusion

La electrofusion evita la toxicidad que posiblemente causa el PEG

 y permite fusionar un rango mas amplio protoplastos con mayor

eficiencia

Factores que pueden influir en la frecuencia de fusión

•           Solo los protoplastos completamente aislados tiene capacidad para fusionarse

•           Protoplastos que ya han sintetizado la nueva pared no se fusionan

•          La concentración y el tipo de enzimas tienen efectos profundos

•           La fluidez de la membrana: fosfolipidos y temperatura (37º C)

•           Fase del ciclo celular de los protoplastos: en la misma etapa de da una mayor frecuencia de fusion (sincronizacion del cultivo)

Selección de los productos de fusión

PRODUCTOS DE LA FUSION DE PROTOPLASTOS

Los núcleos de los protoplastos fusionados pueden fusionarse o permanecer separados

Las células que contienen los diferentes núcleos se denominan heterokarion.

La fusión de los núcleos da como resultado un verdadero hibrido o sinkariocito, también llamado hibrido somático.

La fusión de dos protoplastos de un mismo cultivo resulta en un  homokarion. 

Si uno de los núcleos desaparece completamente, pero el citoplasma de los dos parentales  se hibrida, el producto resultante es conocido como cibrido. La formación de cibridos tiene gran aplicación en el mejoramiento. 

Selección de complementación

Por este método solo las colonias hibridas pueden crecer en un medio selectivo para ellas o pueden distinguirse fácilmente de las colonias progenitoras

Organismo Prototrofico:  Sintetiza todo los que necesita

Auxotrofico:  Necesita de cierto compuesto que no puede producir por si mismo

•           Híbridos somáticos auxotroficos a auxinas  Ej.2 sp de Nicotiana que requieren auxinas

•           Complementación de mutantes albinos no alelicos: se seleccionan los híbridos como colonias verdes entre los albinos, se pueden combinar con otra presión selectiva.

•           El empleo de mutantes deficientes en nitrato reductasa por una parte y la complementación de esta deficiencia enzimático por la otra (P.e. auxotrofia nicotinamida)

•           Los mutantes con resistencia estable a análogos de a.a, los inhibidores metabólicos o los antibióticos son otros procedimientos de selección

• Complementación metabólica: Cuando los marcadores genéticos no están disponibles (ttos de irradiación, yodoacetato, yodoacetamida)

    

Los procesos de selección son de dos tipos:

•          Selección visual

•  Seleccion Bioquimica: hibridos somaticos pueden ser seleccionados usando un medio de crecimiento selectivo, otro metodo depende del uso de mutantes  bioquimicos y la selección de hibridos somaticos por complementacion

Verificación de los híbridos: Métodos

•       Análisis morfológico: fenotipo intermedio por lo general

•       Análisis isoenzimatico: prueba de la presencia y expresión de diferentes alelos de ciertos genes y en consecuencia de la naturaleza híbrida de la planta (en la ribulosa 1,5 -bifosfato carboxilasa, la subunidad mayor es codificada por un gen en el DNA cloroplasto y la subunidad menor por un gen en el DNA nuclear).

• Análisis cromosómico: Alto número de cromosomas, Tetraploides, Anfidiploides. El tamaño en combinaciones intergenéricas

•       Análisis del DNA nuclear: sondas de hibridación.

Consecuencias genéticas de la fusión de protoplastos

Variabilidad genética y eliminación de cromosomas

•           Eliminación aleatoria cromosomica

•          Además de la segregación cromosómica, el reordenamiento cromosómico  puede ser responsable de la variabilidad observada.

Regeneración de plantas y problemas de incompatibilidad

Fusión de protoplastos y genética citoplasmática

Cloroplastos: se ha observado segregación pero no recombinación.

Entre los principales marcadores de la segregación en los diferentes hibridos somaticos tenemos, resistencia a estreptomicina, a la tentoxina, a la atrazina, un patron de subunidad mayor de la rubisco entre otros.

Mitocondria: Se ha sugerido recombinación. La esterilidad citoplasmatica masculina es la principal característica de  las mitocondrias.

El comportamiento independiente del genoma de los cloroplastos y de las mitocondrias  permite la combinación de diferentes características citoplásmicas  mediante la fusión de Pp.

TRANSFERENCIA DE INFORMACIÓN EN LA HIBRIDACIÓN SOMATICA

H. Intraespecifica: Mejoramiento de especies de plantas propagadas vegetativamente.  Ej Solanum tuberosum y S. Brevidens sexualmente incompatibles (resistencia a enfermedades)

H. Interespecifica: Ej. Papa y tomate. Híbrido intermedio para la resistencia al frío

Diferentes caracteres agronómicamente importantes pueden combinarse mediante hibridación somatica. Ej. N. tabacum con esterilidad masculina y N. Glutinosa resistente al TMV

•          Transformacion genetica con protoplastos

•          Se realiza a través de la transferencia de organulos portadores de ADN asi como ADN purificado o los genes clonados en las moleculas vectores de ADN

•          La captacion por los Pp receptores se realiza mediante endocitosis, tratamientos con PEG o PVA, microinyeccion

Ventajas y desventajas de la hibridación somática

•          Variacion genetica

•          Obtener hibridos que sexualmente no son posibles por incompatibilidad

•          Lograr reproduccion sexual de hibridos

•          Bajo vigor hibrido

•          Los protoplastos proveen sistemas para investigar la fisiología y genética de la célula vegetal, incluyendo estudios de genómica y proteómica.

•          La generación de nuevos híbridos somáticos y cíbridos los cuales no pueden ser obtenidos a partir de los métodos tradicionales.

OBTENCION DE PLANTAS HAPLOIDES

Ventajas:

ü  Los caracteres genéticos recesivos y mutaciones inducidas se manifiestan

Aplicaciones:

ü  Constitución de genotipos diploides homocigóticos

ü  Permite obtener líneas resistentes a patógenos

ü  Aceleración de programas de mejora

PROPOSITO:

Producción de haploides

Factores que influyen en el cultivo:

•           Planta donadora: días cortos y altas intensidades de luz

•           Etapa de desarrollo del polen

•           Pretratamientos a flores o inflorescencias

•           Evolución del grano de polen

•           Medio de cultivo

ASPECTOS IMPORTANTES

      

ETAPA DE DESARROLLO DEL POLEN

Premitotico:

Mejor respuesta a partir de anteras en las cuales las microsporas ya han completado la meiosis, pero aun no se ha iniciado la primera division del polen. (Hyoscyamus).

Mitotico:

Mejor respuesta a apartir de anteras en la primera división del polen (Nicotiana tabacum).

Postmitotico:

Mejor respuesta a apartir de anteras en la etapa bicelular temprana del desarrollo del polen.

(Atropa belladonna)

Pretratamientos a flores e inflorescencias:

•           Pretratamiento con temperatura durante 2-30 dias con temperaturas de 3-10°C (Nicotiana, Datura)  o 35°C (Capsicum) pueden estimular embriogenesis

•           Remojar las inflorescencias en agua durante varios dias

•           Centrifugacion de las anteras 

Aplicaciones  del Cultivo de Anteras

•           Fitomejoramiento

El Potencial que posee el cultivo de anteras surge de la constitución genética de las células del polen. Las células del polen de los híbridos F1contienen la dotación genética de las plantas paternas y las recombinaciones esperadas según las proporciones mendelianas  

Estas células son haploides y permiten al mejorador seleccionar eficazmente los recombinantes deseables, alcanzar la homocigosidad  constituye una de las aplicaciones mas importantes del cultivo de anteras  en el desarrollo de variedades nuevas ya que el tiempo, espacio y los costos necesarios para desarrollar líneas verdaderamente mejoradas disminuyen  considerablemente

Especies economicamente importantes en los que se ha integrado esta tecnica con el mejoramiento practica: arroz, cebada, trigo, papa, tabaco, colza oleaginosa y maiz.

Microsporas

Ventajas del cultivo de microsporas sobre el cultivo de anteras:

En el cultivo de anteras , el desarrollo de la microspora no progresa pasada la primera división celular, debido a sustancias inhibitorias en la antera puede presentarse una rapida proliferacion de los tejidos de la pared de la antera, resultando en diploides no homocigoticos. Iniciando el cultivo con microsporas aisladas, siempre se obtendran plantas homocigoticas, aun si ellas son diploides (caso de diferentes cereales) o aun triploides (Petunia)

El cultivo de microsporas da una poblacion homogenea de plantas resultado del desarrollo de microsporas o granos de polen mientras se remueva la pared de la antera.

Ventajas y desventajas de los haploides

•          fenotipo = genotipo

•           La presencia de un solo set de cromosomas, facilita el aislamiento de mutantes,  espontáneas o inducidas

•           Diploides isogenicos pueden ser obtenidos por diploidización  cromosomica

•           Por mejoramiento convencional y retrocruzas, es posible  obtener líneas puras, pero es un tiempo considerable el que se consume en el proceso.  Usando el cultivo de anteras, los haploides pueden ser obtenidos en semanas y por doblamiento cromosómico un gran numero de diploides homocigoticos son obtenidos en una sola generación.

El cultivo de células haploides es también material útil en estudios de la genética de las células somáticas

•            Los haploides pueden ser utilizados para obtener  homocigosis para genes en casos donde es normalmente difícil lograrlo (alelos autoincompatibles).

•           La renuencia a la regeneración en muchas especies y los bajos rendimientos de plantas haploides son limitantes técnicas 

.  Tecnica para duplicar el materia cromosomico

•          Regeneración por métodos de cultivo de tejidos:

Las hojas maduras tienen el potencial de regenerar tanto plantas haploides como diploides, los diploides resultan de la endoreduplicacion  de cromosomas, lo que ocurre frecuentemente en tejidos cultivados in vitro

Doblaje inducido quimicamente con colchicina

El numero de cromosomas puede ser duplicado mediante la aplicacion de colchicina a los embriones o a las plantas haploides  (sumergiendo las anteras que contienen los proembriones en una solucion acuosa con 0.5% de colchicina durante 24 a 48 h)

Cultivo de embriones y Ovulos

Factores que afectan el cultivo de embriones

Genotipo

Condiciones de crecimiento de la planta

Composición del medio nutritivo:  Sales, sacarosa, 

                                                    extractos de plantas

Osmolaridad: depende del estado de dllo del embrión.

Luz  y Temperatura

Aplicaciones Practicas

1. Eliminación de la inhibición total de la germinación de semillas viables
2. Acortar el tiempo de mejora
3. Germinación de semillas que requieren de parásitos obligados
4. Prevención del aborto embrionario en frutales o por resultado de incompatibilidad.

5.  Propagación vegetativa de especies en general (Gramineas y Coniferas) y de especies raras (Musa balbisiana y cocos llamados makapunos)