Curso Cultivo de Tejidos Vegetales: INTRODUCCION AL CULTIVO DE TEJIDOS

CONCEPTUALIZACIÓN Y RETROSPECTIVA HISTÓRICA

Biotecnología

Definición: Uso de organismos vivos o sustancias de ellos para producir o modificar un producto, mejorar plantas o animales o desarrollar microorganismos para usos específicos.

Historicamente: Preparación de pan, cerveza, vino, queso, yogurth

Historia

8000 A C: Domesticación de cultivos, la papa primer cultivo para alimentación

4000-2000 A.C: producción de pan y cerveza a partir de levadura (egipto y mesopotamia), queso y vino

500 A.C : Primer antibiótico

100 D.C: Primer insecticida

1590-1675: Microscopio (Jansen), célula (Hooke), bacteria (Leeuwenhoek)

1830-1833: Descubrimiento de proteínas, primera enzima descubierta y aislada

1835- 1855: Todos los organismos están compuestos por celulas

1857: Pasteur propone que los microbios causan fermentación

1859: Teoría de la Evolución. Charles Darwin

1865: Genética. Mendel descubre la ley de la herencia

1870- 1890: Mejoradores de plantas desarrollan variedades de arroz

1919: Primera vez que usa la palabra biotecnología

1928: Penicilina (Alexander Fleming)

1933: Híbridos de maíz comercialmente disponibles

1942: Producción masiva de penicilina por microorganismos

1944: ADN contiene la información genética (Avery, et al.)

1953: Se describe la estructura del ADN (doble helice, Watson y Crick)

1958: Se obtiene DNA en tubos de ensayo por primera vez

1961: Se registra el primer biopesticida (Bt)

1963: Nuevas variedades de trigo incrementan su producción en un 70%.

Inicia la revolución verde en el mundo de la agricultura

1970: Descubierta la primera enzima de restricción: corta el DNA en sitios específicos

1971: Sintesis completa de un gen

1972: Primera vez que se usa la DNA ligasa y primera molécula recombinante sintética

1975: Se impulsa el trazado de delineamientos para regular experimentos con DNA recombinante

1976: Se determina por primera vez la secuencia de pares de bases para un gen especifico (A,C,T,G)

1977: Desarrollo de procedimientos para secuenciar secciones largas de DNA

1980: Se patenta microorganismos

1983: Primera planta completa originada por biotecnología: Petunia

1986: Primera vacuna para humanos genéticamente diseñada.

1989:Primera prueba en campo de algodón modificado .Se inicia el proyecto genoma.

1990: maiz Bt protección a insectos, primer test en campo de vertebrados diseñados geneticamente

1993: incremento en la producción de leche diaria por uso de BST (Somatotropina bovina modificada)

1994: Aprobación (FDA) del primer alimento producido por biotecnología, Tomate. BST comercializado como POSILAC

1996: Cultivos comerciales resistentes a insectos y malezas (maíz, soya, algodón)

1998: 5 países de Asia forman consorcio para lograr papayas resistentes a enfermedades

2000: Primer mapa completo de genoma de plantas

En 108.9 millones de acres (13 países) crecen ultivos biotecnológicos

Primer cultivo evaluado en campo en Kenya papa dulce resistente a virus

2001: Mapa de genoma del arroz

Clasificación

• B. En Salud Humana (terapia génica)

• B. Animal (vacunas, reproducción, hormonas)

• B. Industrial

• B. Vegetal (mejoramiento de plantas)

• B. Ambiental (limpiar la polución)

Cultivos vegetales

• Cultivos agronómicos

• Cultivos in vitro

1. Tejidos diferenciados (raíces, tallos, embriones, raíces y tallos transformados, organos)

2. Tejidos indiferenciados (callos, suspensiones)

Cultivo in vitro de Tejidos Vegetales

Definición

Cultivo en un medio nutritivo bajo condiciones de esterilidad de cualquier órgano vegetal (semillas, anteras, nudos, petalos etc.)

Cultivo aséptico in vitro de cualquier parte de una planta en un medio nutritivo.

Micropropagacion

Historia

• Sacks y Knops (1860) primeros ensayos

• Votching (1878) polaridad en yemas y raices

• Haberlandt (1898) totipotencialidad

• Haberlandt y Kotte (1922) ensayos en medio enriquecido

• White (1934) cultivo de apices de raiz de tomate

• Morel y Martin (1952) obtencion de plantas libres de virus

• Skoog (1955) descubrimiento de quinetina

• Murashige y Skoog (1965) desarrollo de medio nutritivo funcional para muchas especies

• 1970 numerosos estudios de embriogenesis, organogenesis, hibridacion, fitopatologia

• 1976 estudios de aislamiento y cultivo de protoplastos

• 1977 tamaño y edad fisiologica del inoculo

• 1979 -1983 estudios sobre mutagenesis, embriogenesis, morfogenesis, citogenesis e histogenesis

OBJETIVOS

ü Investigación básica de fisiología, genética, bioquímica y ciencias afines

ü Bioconversión y producción de compuestos útiles

ü Incremento de la variabilidad genética

ü Obtención de plantas libres de patógenos

ü Propagación de plantas

ü Conservación e intercambio de germoplasma

ü Complemento en el mejoramiento de plantas con el uso de la Biología Molecular

Características

• Presupone el cultivo de plantas o partes de plantas (explantos) en un medio de cultivo apropiado.

• El cultivo se desarrolla en condiciones de temperatura, humedad, fotoperíodo e irradiancia controlados.

• La manipulación se realiza en cabinas de flujo laminar.

• Esta técnica es importante en la propagación de especies de interés agroforestal: micropropagación.

• Producen innumerables productos de importancia en la industria farmacéutica, cosmética y alimentaria, como alcaloides, compuestos aromáticos o pigmentos.

• Los cultivos in vitro permiten obviar los inconvenientes derivados de condiciones geográficas, climáticas y de tiempo de producción.

Terminología

Explante: porción de tejido u órgano que se separa de la planta para iniciar el cultivo.

Esterilización: procedimiento para la eliminación de microorganismos.

• Autoclave: aparato en el que el medio, material de vidrio, instrumental, etc., es esterilizado por vapor bajo presión (121^oC, 15 psi, 10-20 min.).

• Requerimientos de asepsia: desinfección de superficie del explanto: generalmente usando lavandina comercial diluido para evitar el desarrollo de microorganismos.

• Cabina de flujo laminar: área de trabajo, mantenida estéril por el flujo continuo, no turbulento de aire

Subcultivo: Transferencia de células, tejidos, órganos, etc. desde un medio de cultivo agotado a otro medio fresco.

Micropropagación: propagación vegetativa in vitro de plantas.

Diferenciación: desarrollo de células o tejidos con una función específica y/o regeneración de órganos, estructuras tipo órganos (raíces, tallos) o embriones.

Adventicio: desarrollo de órganos (raíces, yemas, tallos, flores, etc.) o embriones (embryo-like structures) desde puntos de origen no usuales, incluyendo callos.

Totipotencialidad: Es la capacidad de una célula vegetal de dar lugar al desarrollo de una planta completa. Las células totipotentes son células somáticas que han retenido su capacidad de dividirse y diferenciarse en una planta madura si se coloca en el medio adecuado.

ETAPAS EN LA MICROPROPAGACION:

Etapa 0:Pre - acondicionamiento

Etapa I: Establecimiento

Etapa II: Proliferación

Etapa III: Elongación y enraizamiento

Etapa IV: Aclimatización.

ALGUNAS TÉCNICAS DEL CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES IN VITRO

ü Cultivo de semillas y embriones

ü Cultivo de ovulos y flores explantadas

ü Cultivo de anteras y microsporas

ü Cultivo de segmentos nodales y apices de vastago

ü Cultivo de meristemas

ü Cultivo de discos de hoja

ü Cultivo de células

ü Cultivo de Protoplastos

ORGANIZACIÓN DE UN LABORATORIO DE CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES

REQUERIMIENTOS BASICOS

• Equipos

• Cristaleria

• Reactivos

• Estanterias

AREAS ESPECIFICAS

• Aisladores ( manejo de cada tipo de material vegetal)

• En el laboratorio como tal:

- Área de preparación de medios de cultivo: debe tener una zona independiente para nevera, balanzas, pHmetro, otra para equipos de calor (autoclave, horno, fogón) y la zona de lavado y secado de vidrieria

- Cuarto de siembra (cámara de flujo laminar)

- Cuarto de cultivo (Estanterías)

- Además de un espacio para almacenamiento de reactivos químicos.

ESTERILIZACION

Cristalería e instrumentos: Temperatura (ºC)- Tiempo(min.)

121 15- 30

140 10-20

160 7-15

160-180 5-10

Medios de cultivo, agua y soluciones: Volumen - Tiempo (min.) 121ºC

20-50 15

75 20

250-500 25

1000 30

1500 35

2000 40

Material Vegetal: Etanol al 70 %

Hipoclorito de sodio, (NaClO) , 1-2% durante 5-30 min.

Hipoclorito de Calcio, (Ca(ClO)2), 3.5-10% durante 5-30 min.

Bicloruro de mercurio (HgCl2), al 0.01-0.05% durante 2-12 min.

El esquema de desinfección del material vegetal depende tanto de la especie como del tipo de explante

Locales: Permanganato de Potasio: 1.4 g/m3

Formol al 40%: 12.5 ml/m3

PREPARACION DE MEDIOS

Composición y preparación de medios de cultivo

Formulaciones de diferentes medios

Medios comerciales

Composición:

• Minerales: macro y micronutrientes (N, P, K, Ca, Mg, Cl, Na, Cu, Zn, Mn, Fe, Bo, Mo, Co, I)

• Orgánica: azúcar, vitaminas, productos orgánicos y reguladores de crecimiento antioxidantes

Productos orgánicos: Extracto de levadura, Agua de coco

Hidrolizado de caseina, Albumen inmaduro de maíz

Peptona, Jugo de tomate, plátano, naranja

Extracto de diferentes hongos

Reguladores de crecimiento vegetal

Gelificante y pH

• Minerales

• Los nutrientes son esenciales para el crecimiento y desarrollo de la planta

• Un medio de cultivo debe contener las concentraciones adecuadas de macro y microelementos

• La carencia de un elemento esencial produce un síntoma que sólo es corregido por la adición de este y no por otro

• Macroelementos y Microelementos

• Los Macroelemento son los elementos requeridos por las plantas relativamente en grandes cantidades, los microelementos son los requeridos en pequeñas cantidades

NUTRIENTES
Orgánicos	Primarios	Secundarios	Micronutrientes	Funcionales
C Carbono H Hidrogeno O Oxígeno	N Nitrógeno P Fósforo K Potasio	Mg Magnesio Ca Calcio S Azufre	Mn Manganeso Zn Cinc Fe Hierro Cu Cobre B Boro Mo Molibdeno	Na Sodio V Vanadio Co Cobalto Si Silicio Cl Cloro

• Función de los Elementos

En general dos funciones:

• Función plástica al formar parte de sustancias que forman cuerpo celular

• Función catalítica al formar parte de las enzimas (metaloenzimas) o por activar otras como cofactor

Vitaminas

• Aunque las plantas son autótrofas para las vitaminas, en el medio deben agregarse algunas de ellas hasta que los explantes minimamente logren establecerse

• Algunas vitaminas se utilizan para estimular procesos de crecimiento específicos

• Pero la única vitamina que ha demostrado tener importancia en el cultivo es la Tiamina

• Tiamina

• Piridoxina

• Acido nicotínico

• Glicina

• Mio-inositol

• Pantotenato de calcio

• Biotina

• Riboflavina

• Colina

• Acido fólico