sábado, 24 de septiembre de 2011

TRANSFORMACION GENETICA DE PLANTAS


Transferencia de genes exógenos al interior del genoma vegetal, los cuales previamente han sido modificados in vitro para permitir su expresión mediante un Cassette de expresión donde se ubican genes reporteros, esta construcción es llevada al vector que se emplea como vehículo para transferir las secuencias genómicas al vegetal

La tecnología del DNA Recombinante ofrece la posibilidad de evitar los problemas asociados con el mejoramiento clásico, permitiendo a los genetistas identificar y clonar genes específicos para las características deseables e introducir estos rasgos en las plantas.
Proceso de alteración del genotipo de una célula mediante la introducción de uno o más genes por vía no sexual


Transformación Genética:
          Transferencia mediada por Agrobacterium t.
          Transferencia directa: microinyeccion, electrophoracion, biobalistica

Procedimiento
Corte del gen
Colocarlo dentro del vector
Insertar el vector en el genoma objetivo
Evaluación de la expresión en el organismo modificado
Localización del gen

CARACTERISTICAS
·         Se transfiere directamente o indirectamente ADN
·         Los transgenes pueden provenir de diferentes géneros, familias o reinos
·         El pool genético a utilizar es ilimitado
·         Además del gen de interés se transfieren genes marcadores de selección y genes marcadores de detección

REQUISITOS
          Sistema de regeneración de células blanco
          Secuencias génicas (estructural y reguladora) necesarias para la expresión
          Sistema de transformación biológica o física para introducir el o los genes
          Estrategia de selección de células/plantas transformadas


Genes marcadores

Genes reporteros: Confieren a la célula transformada una característica nueva que la hace distinguible de las no transformadas.
Pueden ser detectados a traves de sus productos de expresion ( enzimas)
Permiten evaluar cualitativa y cuantitativamente  la expresion genica
Gen gus: codifica para β-glucuronidasa
La enzima β-glucuronidasa reacciona con el sustrato NPG el cual al ser hidrolizado se puede cuantificar espectrofotometricamente
La deteccion fluorometrica de GUS emplea como sustrato el MUG en el cual el producto final es fluorescente
La deteccion histoquimica se realiza con el sustrato X-Gluc el cual bajo accion de la enzima produce un precipitado azul
La β-glucuronidasa no tiene efectos negativos sobre el desarrollo y reproduccion de los vegetales, puede ser transportada a traves de las membranas y permite analizar desde celulas aisladas hasta tejidos completos

Marcadores de selección: son aquellos que al ser incorporados en plantas, les confieren resistencia a antibioticos o herbicidas de amplio espectro permitiendo la selección de transformantes

Ya que no existe un gen que de manera uniforme confiera resistencia a la misma sustancia en todas las especies son necesarios marcadores adicionales para repetir la transformacion en individuos transgenicos
Genes marcadores mas utilizados nptII, bar, hpt y sul

Metodos de Transferencia de genes a plantas


Métodos directos                                                               
Electroporacion
Microinyección   
Biobalística                                       


ELECTROPORACIÓN
Es el proceso por el cual las membranas bilipidicas se vuelven permeables en forma reversible, producto de la aplicación de campos electricos de alta intensidad.
Cuando la membrana celular es polarizada por alto voltaje, se forman poros que permiten el intercambio de compuestos entre el medio intra y extracelular, este efecto es transitorio y despues de un lapso de tiempo la impermeabilidad y resistencia de las celulas es reestablecida, el pulso de electroporacion es generado por la descarga de un capacitor a traves de electrodos colocados en una cubeta diseñada para estos fines, en esta son colocados los blancos biologicos  y el ADN plasmidico que porta la informacion genetica que se desea expresar, ambos en un buffer de composicion y conductancia electrica conocidas





Ventajas y desventajas del metodo
  Al comparar la electroporacion con otros metodos directos esta los supera respecto a la mayor facilidad de controlar los factores que influyen positivamente en la obtencion de buenos resultados
  Como principal desventaja se tiene la de necesitar un gran numero de manipulaciones y necesitar gran cantidad de ADN para cada ensayo


BIOBALISTICA
Introduccion directa de acidos nucleicos a celulas intactas, tejidos y organos a traves del disparo de microproyectiles con una pistola de genes 




PARAMETROSA TENER EN CUENTA
Parámetros referidos al acelerador
  La fuente de energía
  El macroproyectil: Forma cilíndrica o circular
  Vacio
  Pantalla dispersora de macroparticulas
 Velocidad del impacto: Presión, recorrido y distancia de ubicación del impacto
 
Parámetros de los microproyectiles
Tipo de microproyectil (tungsteno, oro, platino etc. )
 Tamaño de la partícula
 Recubrimiento de la partícula con el DNA (CaCl2 Y espermidina)
 Ubicación de la partícula en el macroproyectil.

 Parámetros Biológicos
  Estado fisiológico
  Tipo de blanco
  Origen del blanco
  Tamaño del blanco
  Peso molecular y naturaleza (Cadena doble o simple) de la biomolecula
  Ventajas y desventajas
  Es un  metodo de aplicación general
  Intervienen protocolos de trabajo simples y rapidos
  Emplea pequeñas cantidades de ADN y los tejidos blanco pueden ser muy variados no necesitando una preparacion compleja
  El equipamiento es facil de manipular
  Parametros fisicos pueden ser variados a conveniencia
  Es un metodo de menor reproducibilidad

 METODOS INDIRECTOS
  Agrobacterium:
Bacteria Gram-Negativa de la Familia Rhizobiaceae, tiene dos especies de interés A. tumefaciens y A.rhizogenes




TRANSFORMACIÓN MEDIADA POR Agrobacterium
La bacteria del genero Agrobacterium es patógena de plantas causante de la enfermedad conocidacomo Agalla de la corona o tumor en el sitio de la infección, al iniciarse la patogenia en la planta se inducen la produccion de hormonas y opinas, estas ultimas empleadas por la bacteria como fuente de carbono y nitrógeno. Agrobacterium tiene megaplasmidos caracteristicos de entre 140-235 kb, se conocen como plasmidos Ti (induccion de tumor)
Estos plasmidos poseen cuatro regiones principales:
ADN-T: region que se escinde y luego se integra en la celula vegetal, secuencias borde
VIR: region de 35 kb, que codifica para la mayoria de las funciones de virulencia
ORI: origen de replicacion
CON: secuencia que codifica para funciones de conjugacion
200 kb aprox.
Región vir
 T-DNA
Síntesis   de opinas





Figura 6:  Mapa genético de un vector co-integrado


Figura 7:  Transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens



CONFIRMACIÓN DE TRANSFORMACION ESTABLE
Detección de ADN transgen en ADN genómico (Southern)
 Detección de RNAm del transgen (Northern)
 Presencia de la proteína o actividad enzimático (Western)
Estabilidad
Integridad
Numero de copias
Herencia
Nivel de expresion










APLICACIONES EN EL MEJORAMIENTO GENETICO
Resistencia al ataque por insectos
Resistencia a virus
Resistencia a herbicidas
Mejora de la calidad de los frutos
Mejora de la calidad nutricional
Resistencia a hongos patogenos



No hay comentarios:

Publicar un comentario