domingo, 28 de agosto de 2011

INTRODUCCION AL CULTIVO DE TEJIDOS




CONCEPTUALIZACIÓN Y  RETROSPECTIVA HISTÓRICA
Biotecnología
Definición: Uso de organismos vivos o sustancias de ellos para producir o modificar un producto, mejorar plantas o animales o  desarrollar microorganismos para usos específicos.
Historicamente:  Preparación de pan, cerveza, vino, queso, yogurth
Historia  
8000 A C: Domesticación de cultivos, la papa primer cultivo para alimentación
4000-2000 A.C: producción de pan y cerveza a partir de levadura (egipto y mesopotamia), queso y vino
500 A.C : Primer antibiótico          
100 D.C: Primer insecticida
1590-1675: Microscopio (Jansen), célula (Hooke), bacteria (Leeuwenhoek)
1830-1833: Descubrimiento de proteínas, primera enzima descubierta y aislada
1835- 1855: Todos los organismos están compuestos por celulas
1857: Pasteur propone que los microbios causan fermentación
1859: Teoría de la Evolución.  Charles Darwin
1865: Genética. Mendel descubre la ley de la herencia
1870- 1890: Mejoradores de plantas desarrollan variedades de arroz
1919: Primera vez que usa la palabra biotecnología
1928: Penicilina (Alexander Fleming)
1933: Híbridos de maíz comercialmente disponibles
1942: Producción masiva de penicilina por microorganismos
1944: ADN contiene la información genética (Avery, et al.)
1953: Se describe la estructura del ADN (doble helice, Watson y Crick)
1958: Se obtiene DNA en tubos de ensayo por primera vez
1961: Se registra el primer biopesticida (Bt)
1963: Nuevas variedades de trigo incrementan su producción en un 70%.
          Inicia la revolución verde en el mundo de la agricultura
1970: Descubierta la primera enzima de restricción: corta el DNA en sitios específicos
1971: Sintesis completa de un gen
1972: Primera vez que se usa la DNA ligasa y primera molécula recombinante sintética
1975: Se impulsa el trazado de delineamientos para regular experimentos con DNA recombinante
1976: Se determina por primera vez la secuencia de pares de bases para un gen especifico (A,C,T,G)
1977: Desarrollo de procedimientos para secuenciar secciones largas de DNA
1980: Se patenta microorganismos
1983: Primera planta completa originada por biotecnología: Petunia
1986: Primera vacuna para humanos genéticamente diseñada.
1989:Primera prueba en campo de algodón modificado .Se inicia el proyecto genoma. 
1990: maiz Bt protección a insectos, primer test en campo de vertebrados diseñados geneticamente
1993: incremento en la producción de leche diaria por uso de BST (Somatotropina bovina modificada)
1994: Aprobación (FDA) del primer alimento producido por biotecnología, Tomate. BST comercializado como POSILAC
1996: Cultivos comerciales resistentes a insectos y malezas (maíz, soya, algodón)
1998: 5 países de Asia forman consorcio para lograr papayas resistentes a enfermedades
2000: Primer mapa completo de genoma de plantas
En 108.9 millones de acres (13 países) crecen ultivos biotecnológicos
Primer cultivo evaluado en campo en Kenya papa dulce resistente a virus
2001: Mapa de genoma del arroz




Clasificación
           B. En Salud Humana (terapia génica)
           B. Animal (vacunas, reproducción, hormonas)
           B. Industrial
           B. Vegetal (mejoramiento de plantas)
           B. Ambiental (limpiar la polución)
  
Cultivos vegetales
          Cultivos agronómicos
          Cultivos in vitro
1.    Tejidos diferenciados (raíces, tallos, embriones, raíces y tallos transformados, organos)
2.    Tejidos indiferenciados (callos, suspensiones)

Cultivo in vitro de Tejidos Vegetales
Definición
 Cultivo en un medio nutritivo  bajo condiciones de esterilidad de cualquier órgano vegetal (semillas, anteras, nudos, petalos etc.)
Cultivo aséptico in vitro de cualquier parte de una planta en un medio nutritivo.
Micropropagacion
Historia
          Sacks y Knops (1860) primeros ensayos
          Votching (1878) polaridad  en yemas y raices
          Haberlandt (1898) totipotencialidad
          Haberlandt y Kotte (1922) ensayos en medio enriquecido
          White (1934) cultivo de apices de raiz de tomate
          Morel y Martin (1952) obtencion de plantas libres de virus
          Skoog (1955) descubrimiento de quinetina
          Murashige y Skoog (1965) desarrollo de medio nutritivo funcional para muchas especies
          1970 numerosos estudios de embriogenesis, organogenesis, hibridacion, fitopatologia
          1976 estudios de aislamiento y cultivo de protoplastos
          1977 tamaño y edad fisiologica del inoculo
          1979 -1983 estudios sobre mutagenesis, embriogenesis, morfogenesis, citogenesis e histogenesis
OBJETIVOS
ü  Investigación básica de fisiología, genética,     bioquímica y ciencias afines
ü  Bioconversión y producción de compuestos útiles
ü  Incremento de la variabilidad genética
ü  Obtención de plantas libres de patógenos
ü  Propagación de plantas
ü  Conservación e intercambio de germoplasma
ü  Complemento en el mejoramiento de plantas con el uso de la Biología Molecular

Características
          Presupone el cultivo de plantas o partes de plantas (explantos) en un medio de cultivo apropiado.
          El cultivo se desarrolla en condiciones de temperatura, humedad, fotoperíodo e irradiancia controlados.
          La manipulación se realiza en cabinas de flujo laminar.
          Esta técnica es importante en la propagación de especies de interés agroforestal: micropropagación.
          Producen innumerables productos de importancia en la industria farmacéutica, cosmética y alimentaria, como alcaloides, compuestos aromáticos o pigmentos.
          Los cultivos in vitro permiten obviar los inconvenientes derivados de condiciones geográficas, climáticas y de tiempo de producción.
Terminología
Explante: porción de tejido u órgano que se separa de la planta para iniciar el cultivo.
Esterilización: procedimiento para la eliminación de microorganismos.
           Autoclave: aparato en el que el medio, material de vidrio, instrumental, etc., es esterilizado por vapor bajo presión  (121oC, 15 psi, 10-20 min.).
          Requerimientos de asepsia: desinfección de superficie del explanto: generalmente usando lavandina comercial diluido para evitar el desarrollo de microorganismos.
          Cabina de flujo laminar: área de trabajo, mantenida estéril por el flujo continuo, no turbulento de aire
Subcultivo: Transferencia de células, tejidos, órganos, etc. desde un medio de cultivo agotado a otro medio fresco.
 Micropropagación: propagación vegetativa in vitro de plantas.
Diferenciación: desarrollo de células o tejidos con una función específica y/o regeneración de órganos, estructuras tipo órganos (raíces, tallos) o embriones.
Adventicio: desarrollo de órganos (raíces, yemas, tallos, flores, etc.) o embriones (embryo-like structures) desde puntos de origen no usuales, incluyendo callos.
Totipotencialidad: Es la capacidad de una célula vegetal de dar lugar al desarrollo de una planta completa. Las células totipotentes son células somáticas que han retenido su capacidad de dividirse y diferenciarse en una planta madura si se coloca en el medio adecuado.


ETAPAS EN LA MICROPROPAGACION:
 Etapa 0:Pre - acondicionamiento
 Etapa I: Establecimiento
 Etapa II: Proliferación
 Etapa III: Elongación y enraizamiento
 Etapa IV: Aclimatización.

ALGUNAS TÉCNICAS DEL CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES IN VITRO
ü  Cultivo de semillas y embriones
ü  Cultivo de ovulos y flores explantadas
ü  Cultivo de anteras y microsporas
ü   Cultivo de segmentos nodales y apices de vastago
ü   Cultivo de meristemas
ü  Cultivo de discos de hoja
ü   Cultivo de células
ü   Cultivo de Protoplastos


ORGANIZACIÓN DE UN LABORATORIO DE CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES
REQUERIMIENTOS BASICOS
           Equipos
           Cristaleria
           Reactivos
           Estanterias
AREAS ESPECIFICAS
           Aisladores ( manejo de cada tipo de material vegetal)
            En el laboratorio como tal:
  - Área de preparación de medios de cultivo: debe tener una  zona independiente para nevera, balanzas, pHmetro, otra para equipos de calor (autoclave, horno, fogón) y la zona de lavado y secado de vidrieria  
  - Cuarto de siembra (cámara de flujo laminar)
  - Cuarto de cultivo (Estanterías)
  - Además de un espacio para almacenamiento de reactivos químicos.


ESTERILIZACION
Cristalería e instrumentos:  Temperatura (ºC)- Tiempo(min.)
                                                   121              15- 30
                                                   140              10-20
                                                   160               7-15
                                                   160-180           5-10
Medios de cultivo, agua y soluciones:    Volumen - Tiempo (min.) 121ºC
                                                                    20-50           15
                                                                     75               20
                                                                   250-500        25
                                                                    1000            30
                                                                    1500            35
                                                                     2000           40                                      
Material Vegetal:  Etanol al 70 %
                           Hipoclorito de sodio, (NaClO) , 1-2% durante 5-30 min.
                           Hipoclorito de Calcio, (Ca(ClO)2), 3.5-10% durante 5-30 min.
                           Bicloruro de mercurio (HgCl2), al 0.01-0.05% durante 2-12 min.
El esquema de desinfección del material vegetal depende tanto de la especie como del tipo de explante
                                                     
Locales: Permanganato de Potasio: 1.4 g/m3
                                      Formol al 40%:  12.5 ml/m3

PREPARACION DE MEDIOS
Composición y preparación de medios de cultivo
Formulaciones de diferentes medios
Medios comerciales
Composición:
           Minerales: macro y micronutrientes (N, P, K, Ca, Mg, Cl, Na, Cu, Zn, Mn, Fe, Bo, Mo, Co, I)
           Orgánica: azúcar, vitaminas, productos orgánicos y reguladores de crecimiento antioxidantes
Productos orgánicos: Extracto de levadura,  Agua de coco
                                        Hidrolizado de caseina, Albumen inmaduro de maíz
                                        Peptona, Jugo de tomate, plátano, naranja
                                        Extracto de diferentes hongos                                      
                                      
Reguladores de crecimiento vegetal
Gelificante y pH
          Minerales
          Los nutrientes son esenciales para el crecimiento y desarrollo de la planta
          Un medio de cultivo debe contener las concentraciones adecuadas de macro y microelementos
          La carencia de un elemento esencial produce un síntoma que sólo es corregido por la adición de este y no por otro
          Macroelementos y Microelementos
          Los Macroelemento son los elementos  requeridos por las plantas  relativamente en grandes cantidades, los microelementos son los requeridos en pequeñas cantidades

NUTRIENTES
Orgánicos
Primarios
Secundarios
Micronutrientes
Funcionales
C Carbono
H Hidrogeno

O Oxígeno
N Nitrógeno

P Fósforo
K Potasio
Mg Magnesio
Ca Calcio
S Azufre
Mn Manganeso
Zn Cinc
Fe Hierro
Cu Cobre
B Boro
Mo Molibdeno
Na Sodio
V Vanadio
Co Cobalto
Si Silicio
Cl Cloro

      Función de los Elementos
En general dos funciones:
          Función plástica al formar parte de sustancias que forman cuerpo celular
          Función catalítica al formar parte de las enzimas (metaloenzimas) o por activar otras como cofactor 


Vitaminas
          Aunque las plantas son autótrofas para las vitaminas, en el medio deben agregarse algunas de ellas hasta que los explantes minimamente  logren establecerse
          Algunas vitaminas se utilizan para estimular procesos de crecimiento específicos
          Pero la única vitamina que ha demostrado tener importancia en el cultivo es la Tiamina
          Tiamina
          Piridoxina
          Acido nicotínico
          Glicina
          Mio-inositol
          Pantotenato de calcio
          Biotina
          Riboflavina
          Colina
          Acido fólico
          Tocoferol
          Acido ascórbico
          Retinol
          Calciferol

REGULADORES DE CRECIMIENTO
          Las hormonas regulan reacciones metabólicas, no cumplen papel nutritivo.
          Son conocidas como Fitohormonas
          Su formas sintéticas son denominadas reguladores del crecimiento
          Dentro de este grupo se encuentran:
          Los promotores del crecimiento: Auxinas, Citocininas y Giberelinas.
          Las auxinas y las giberelinas estimulan principalmente la elongación celular,
          Las citocininas estimulan la división celular
          Inhibidores del crecimiento: Acido Abscísico, etileno, compuestos Fenólicos

  









Medios Basales
          El optimizar las necesidades particulares de una planta ha proporcionado algunas mezclas de sales con el resultado de diferentes medios basales
          De estas mezclas una de ellas tiene un uso más generalizado y son las sales Murashige y Skoog (1962)
          Las sales MS contienen grandes cantidades de macroelementos y su valor es atribuido al gran contenido de NH4+ y K en forma de NH4NO3 y KNO3



Condiciones de Cultivo
Temperatura
Humedad relativa
Fotoperíodo

Preparación medios de cultivo






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