sábado, 24 de septiembre de 2011

HIBRIDACION SOMATICA Y OBTENCION DE PLANTAS HAPLOIDES

PROTOPLASTO

          Unidad de protoplasma contenido dentro de una célula
          Unidad homeostática básica de la célula en la que no esta involucrada la pared celular  (Hanstein)
          1892 primer reporte de aislamiento y obtención de un protoplasto


Características de los protoplastos
Tienen la capacidad de producir un organismo altamente diferenciado a partir de una sola célula
       Forma esférica
      Tienen la capacidad de regenerar la pared celular, multiplicarse  regenerar plantas completas
        Pueden incorporar macromoleculas, virus, partículas virales
       Pueden fusionarse entre si, dando origen a híbridos     intergenericos  p.e en maíz y soya
        Heterocariocitos interespecificos, intergenericos e interreinos
        Herramienta ideal para inducción de mutaciones y en el cultivo de células vegetales
    De gran utilidad  en estudios básicos en morfologia, fisiología, hibridación somática, propagación, fitomejoramiento
     Razones para realizar el cultivo de protoplastos
 En los protoplastos puede inducirse la fusion para producir plantas híbridas, las cuales no pueden ser logradas por métodos convencionales debido a la incompatibilidad
  Los protoplastos son capaces de ingerir material foráneo dentro del citoplasma, este material incluye:
introducción de núcleo, cloroplastos, mitocondria, DNA, plasmidos, bacteria
y virus.
          Para estudios de síntesis de pared y deposición
  Los protoplastos pueden ser estudiados como sistemas celulares Independientes.
   Han sido aislados a partir de  multiples especies y de casi todas las partes vegetales como raiz, nodulos radiculares, tejido de frutos, pericarpio, petalos florales, tuberculos, endospermo, celulas de mesofilo siendo la mejor fuente de estos las hojas en estado juvenil y con crecimiento activo o las suspensiones celulares

La operación fundamental para el aislamiento de Pp es la remoción de la pared celular sin causar daño al protoplasma

METODO MECANICO: se sumerge el tejido en una solucion hipertonica provocando plasmolisis
Ya plasmolizadas las celulas se secciona el tejido y se liberan los protoplastos
Este metodo evita el daño metabolico causado por el uso de enzimas, pero se obtiene una pequeña cantidad de protoplastos

          Metodo enzimatico
          Tratar el tejido con una mezcla de enzimas degradantes de la pared
          Celulasas, hemicelulasas, pectinasas
p. ej: pectinasa para separar celulas del mesofilo y celulasa para degradar pared celular
          Se obtiene un mayor numero de Pp
          Impide que las celulas se rompan
          Método enzimático, aspectos a considerar
         
Enzimas:
          Celulasa: Onozuka  R10, Driselasa, Celulisina, Meicelasa
          Hemicelulasa: Rhozima HP 150, Hemicelulasa
          Pectinasa: Macerozima R 10, Macerasa, Pectiolasa Y 23
          Purificación de la enzimas a utilizar
          Medio de incubación: Sales (CaCL2, KH2PO4, MgCl2)
                                             Medio de cultivo
                                             Amortiguador (fosfato, MES)
                                             Estabilizador osmótico (manitol, sorbitol,
                                                      sacarosa, glucosa): 0.3-0.7M
          Ph : 5.0-6.0
          Duración del tratamiento: Material  Fuente



           
          CULTIVO

          Material de origen de los protoplastos 
     Edad
          Densidad de la población: 104 – 105  protoplastos/ml
          Sistemas de Cultivo: líquidos (capas delgadas y gotas)
                                          y sólidos (mezcla de proto y el medio)
          Composición de los medios
                  Sales inorganicas: bajos niveles de sustancias inorgánicas
                    Estabilizadores osmoticos: sorbitol, manitol, glucosa y sacarosa
                    Reguladores de crecimiento
                    Otros componentes: extracto de levadura, caseína hidrolizada
                                                     a.a., vitaminas, ácidos orgánicos entre otros
          Tipo de enzimas: mezcla de enzimas
          Desarrollo del cultivo
          Regeneración de la pared celular
          División celular
          Evaluación de la eficiencia
           
CARACTERISTICAS DE LOS PROTOPLASTOS AISLADOS
          Las poblaciones de protoplastos recién aislados refleja las
propiedades Morfológicas y fisiológicas de las células de las cuales
se derivan
            mesofilo: cloroplastos
           
           Conservan la heterogeneidad del tejido original, pudiendose
Reagruparlos por centrifugación, en gradientes iso-osmoticos de
densidad, o clasificarse por flujo y citometria.
           Cambios claramente caracterizados en su metabolismo por el
efecto del estrés osmótico, la remoción de la pared celular,
de la ruptura de los plasmodesmos y del ambiente nuevo a que estos
están sometidos.
El choque osmotico ocasiona cambios en el patrón del RNA y síntesis
de proteínas      (Proteínas de choque osmótico)



EFICIENCIA DEL CULTIVO
DENSIDAD DE SIEMBRA

Los Pp tienen un maximo y un minimo de densidad de siembra para el crecimiento
La eficiencia optima de siembra  (para Pp de tabaco) es de 5 x 104 Pp/cm3.
Los Pp no se dividen cuando se siembran a una decima parte de esa concentracion
La concentracion de los protoplastos puede  ser determinada por un hemocitometro Fuchs-Rosenthal modificado con una profindidad de campo de 0,2 mm, es posible ajustar la concentración de protoplastos en el nivel apropiado de dilución o concentración después de la centrifugación


TEST DE VIABILIDAD

Diacetato de fluoresceina
Azul de Evans
: la impermeabilidad de la celula al azul de Evans indica que es una celula viva.
 La ciclosis  puede ser una medida de viabilidad
Tasa de supervivencia
TS:  Protoplastos que sobreviven/
Protoplastos totales
Los Pp de mesofilo empiezan a regenerar nueva pared celular a unas pocas horas de su aislamiento, sin embargo puede tomar varios dias completar la biosintesis de la pared
Esto puede ser observado microscopicamente usando Calcofluor blanco, el medio de contraste blanco se une al material de la pared y fluoresce con luz azul
Una vez los Pp han regenerado la pared celular, se empiezan a dividir y a formar callos, estos callos pueden ser subcultivados. El callo puede sufrir embriogenesis u organogenesis despues de 3 a 4 semanas en condiciones de cultivo correctas. Los embrioides/organos crecen de la misma manera como la mayoria de plantulas cultivadas in vitro.  
La posibilidad de regenerar plantas a partir de protoplastos aislados
es relativamente baja. Para el año 1983 solo era posible realizarlo en
Solanaceas: Nicotiana, Petunia, Solanum, Lycopersicum, Atropa, Browallia
                     Capsicum, Datura, Hyoseyamus
Otras Familias: Daucus carota, Manihot esculenta, Medicago sativa, Trifolium
                          repens, Brassica napus, Asparragus officinalis y Citrus sinensis
Las gramíneas (excepto el arroz) son difíciles de regenerar (Potrykus et al., 1983)



Hibridación somática


          Barreras de incompatibilidad: en el caso del polen no hay compatibilidad de sustancias para romper la exina y formar el tubo polinico
           La producción de híbridos somáticos anfidiploides (diploides originados por la hibridación de haploides) y fértiles de especies incompatibles
           Producción de líneas heterocigóticas dentro de una especie que normalmente solo se propaga por vía vegetativa
           La transferencia de solo una parte de la información nuclear de una especie a otra mediante el fenómeno de eliminación de cromosomica
           Transferencia de información genética citoplasmática de una línea o especie a otra
          Fusion de Pp
Actualmente es posible fusionar casi cualquier tipo de Pp
          Fusion espontanea: puede darse durante la fase de aislamiento, es mas probable cuando el Pp proviene de cultivos celulares con rapida división
                Durante la fase de aislamiento ya que tana pronto la pared es degradada las conexiones de los plasmodesmos entre celulas vecinas se alargan y expanden hasta permitir el paso de organelos completos a la celula adyacente (Pp multinucleados)


FUSION INDUCIDA
AGENTES INDUCTORES

QUIMICOS
          Sales inorgánicas: nitrato de sodio, en los primeros trabajos
           Alto contenido de calcio y alto pH (10.5): Keller et al. (1974)
 Los fosfolipidos de membrana tienden a repelerse mutuamente a pH fisiológico. El Ca++ y pH redistribución de cargas y formación de puentes de Ca++                   distorsiones de la membrana y mas adelante fusión
           Polietilen glicol (PEG) se ha utilizado exitosamente para fusionar diferentes protoplastos vegetales. Propicia agregación adicional

Fusión: en tubos de centrifuga mezclando la solución de PEG
con la suspensión de protoplastos

Electrofusion
La electrofusion evita la toxicidad que posiblemente causa el PEG
 y permite fusionar un rango mas amplio protoplastos con mayor
eficiencia


Factores que pueden influir en la frecuencia de fusión
           Solo los protoplastos completamente aislados tiene capacidad para fusionarse
           Protoplastos que ya han sintetizado la nueva pared no se fusionan
          La concentración y el tipo de enzimas tienen efectos profundos
           La fluidez de la membrana: fosfolipidos y temperatura (37º C)
           Fase del ciclo celular de los protoplastos: en la misma etapa de da una mayor frecuencia de fusion (sincronizacion del cultivo)
Selección de los productos de fusión


PRODUCTOS DE LA FUSION DE PROTOPLASTOS
Los núcleos de los protoplastos fusionados pueden fusionarse o permanecer separados
Las células que contienen los diferentes núcleos se denominan heterokarion.
La fusión de los núcleos da como resultado un verdadero hibrido o sinkariocito, también llamado hibrido somático.
La fusión de dos protoplastos de un mismo cultivo resulta en un  homokarion
Si uno de los núcleos desaparece completamente, pero el citoplasma de los dos parentales  se hibrida, el producto resultante es conocido como cibrido. La formación de cibridos tiene gran aplicación en el mejoramiento. 






Selección de complementación
Por este método solo las colonias hibridas pueden crecer en un medio selectivo para ellas o pueden distinguirse fácilmente de las colonias progenitoras
Organismo Prototrofico:  Sintetiza todo los que necesita
Auxotrofico:  Necesita de cierto compuesto que no puede producir por si mismo

           Híbridos somáticos auxotroficos a auxinas  Ej.2 sp de Nicotiana que requieren auxinas
           Complementación de mutantes albinos no alelicos: se seleccionan los híbridos como colonias verdes entre los albinos, se pueden combinar con otra presión selectiva.
           El empleo de mutantes deficientes en nitrato reductasa por una parte y la complementación de esta deficiencia enzimático por la otra (P.e. auxotrofia nicotinamida)
           Los mutantes con resistencia estable a análogos de a.a, los inhibidores metabólicos o los antibióticos son otros procedimientos de selección
 Complementación metabólica: Cuando los marcadores genéticos no están disponibles (ttos de irradiación, yodoacetato, yodoacetamida)
    


Los procesos de selección son de dos tipos:
          Selección visual
  Seleccion Bioquimica: hibridos somaticos pueden ser seleccionados usando un medio de crecimiento selectivo, otro metodo depende del uso de mutantes  bioquimicos y la selección de hibridos somaticos por complementacion


Verificación de los híbridos: Métodos
       Análisis morfológico: fenotipo intermedio por lo general
       Análisis isoenzimatico: prueba de la presencia y expresión de diferentes alelos de ciertos genes y en consecuencia de la naturaleza híbrida de la planta (en la ribulosa 1,5 -bifosfato carboxilasa, la subunidad mayor es codificada por un gen en el DNA cloroplasto y la subunidad menor por un gen en el DNA nuclear).
 Análisis cromosómico: Alto número de cromosomas, Tetraploides, Anfidiploides. El tamaño en combinaciones intergenéricas
       Análisis del DNA nuclear: sondas de hibridación.


Consecuencias genéticas de la fusión de protoplastos
Variabilidad genética y eliminación de cromosomas
           Eliminación aleatoria cromosomica
          Además de la segregación cromosómica, el reordenamiento cromosómico  puede ser responsable de la variabilidad observada.
Regeneración de plantas y problemas de incompatibilidad
Fusión de protoplastos y genética citoplasmática
Cloroplastos: se ha observado segregación pero no recombinación.
Entre los principales marcadores de la segregación en los diferentes hibridos somaticos tenemos, resistencia a estreptomicina, a la tentoxina, a la atrazina, un patron de subunidad mayor de la rubisco entre otros.
Mitocondria: Se ha sugerido recombinación. La esterilidad citoplasmatica masculina es la principal característica de  las mitocondrias.
El comportamiento independiente del genoma de los cloroplastos y de las mitocondrias  permite la combinación de diferentes características citoplásmicas  mediante la fusión de Pp.

TRANSFERENCIA DE INFORMACIÓN EN LA HIBRIDACIÓN SOMATICA

H. Intraespecifica: Mejoramiento de especies de plantas propagadas vegetativamente.  Ej Solanum tuberosum y S. Brevidens sexualmente incompatibles (resistencia a enfermedades)
H. Interespecifica: Ej. Papa y tomate. Híbrido intermedio para la resistencia al frío
Diferentes caracteres agronómicamente importantes pueden combinarse mediante hibridación somatica. Ej. N. tabacum con esterilidad masculina y N. Glutinosa resistente al TMV
          Transformacion genetica con protoplastos
          Se realiza a través de la transferencia de organulos portadores de ADN asi como ADN purificado o los genes clonados en las moleculas vectores de ADN
          La captacion por los Pp receptores se realiza mediante endocitosis, tratamientos con PEG o PVA, microinyeccion


Ventajas y desventajas de la hibridación somática
          Variacion genetica
          Obtener hibridos que sexualmente no son posibles por incompatibilidad
          Lograr reproduccion sexual de hibridos
          Bajo vigor hibrido
          Los protoplastos proveen sistemas para investigar la fisiología y genética de la célula vegetal, incluyendo estudios de genómica y proteómica.
          La generación de nuevos híbridos somáticos y cíbridos los cuales no pueden ser obtenidos a partir de los métodos tradicionales.

OBTENCION DE PLANTAS HAPLOIDES




Ventajas:
ü  Los caracteres genéticos recesivos y mutaciones inducidas se manifiestan
Aplicaciones:
ü  Constitución de genotipos diploides homocigóticos
ü  Permite obtener líneas resistentes a patógenos
ü  Aceleración de programas de mejora




PROPOSITO:
Producción de haploides
Factores que influyen en el cultivo:
           Planta donadora: días cortos y altas intensidades de luz
           Etapa de desarrollo del polen
           Pretratamientos a flores o inflorescencias
           Evolución del grano de polen
           Medio de cultivo


ASPECTOS IMPORTANTES

      
ETAPA DE DESARROLLO DEL POLEN
Premitotico:
Mejor respuesta a partir de anteras en las cuales las microsporas ya han completado la meiosis, pero aun no se ha iniciado la primera division del polen. (Hyoscyamus).

Mitotico:
Mejor respuesta a apartir de anteras en la primera división del polen (Nicotiana tabacum).

Postmitotico:
Mejor respuesta a apartir de anteras en la etapa bicelular temprana del desarrollo del polen.
(Atropa belladonna)

Pretratamientos a flores e inflorescencias:
           Pretratamiento con temperatura durante 2-30 dias con temperaturas de 3-10°C (Nicotiana, Datura)  o 35°C (Capsicum) pueden estimular embriogenesis
           Remojar las inflorescencias en agua durante varios dias
           Centrifugacion de las anteras 


Aplicaciones  del Cultivo de Anteras

           Fitomejoramiento
El Potencial que posee el cultivo de anteras surge de la constitución genética de las células del polen. Las células del polen de los híbridos F1contienen la dotación genética de las plantas paternas y las recombinaciones esperadas según las proporciones mendelianas  
Estas células son haploides y permiten al mejorador seleccionar eficazmente los recombinantes deseables, alcanzar la homocigosidad  constituye una de las aplicaciones mas importantes del cultivo de anteras  en el desarrollo de variedades nuevas ya que el tiempo, espacio y los costos necesarios para desarrollar líneas verdaderamente mejoradas disminuyen  considerablemente
Especies economicamente importantes en los que se ha integrado esta tecnica con el mejoramiento practica: arroz, cebada, trigo, papa, tabaco, colza oleaginosa y maiz.


Microsporas

Ventajas del cultivo de microsporas sobre el cultivo de anteras:
En el cultivo de anteras , el desarrollo de la microspora no progresa pasada la primera división celular, debido a sustancias inhibitorias en la antera puede presentarse una rapida proliferacion de los tejidos de la pared de la antera, resultando en diploides no homocigoticos. Iniciando el cultivo con microsporas aisladas, siempre se obtendran plantas homocigoticas, aun si ellas son diploides (caso de diferentes cereales) o aun triploides (Petunia)
El cultivo de microsporas da una poblacion homogenea de plantas resultado del desarrollo de microsporas o granos de polen mientras se remueva la pared de la antera.



Ventajas y desventajas de los haploides
          fenotipo = genotipo
           La presencia de un solo set de cromosomas, facilita el aislamiento de mutantes,  espontáneas o inducidas
           Diploides isogenicos pueden ser obtenidos por diploidización  cromosomica
           Por mejoramiento convencional y retrocruzas, es posible  obtener líneas puras, pero es un tiempo considerable el que se consume en el proceso.  Usando el cultivo de anteras, los haploides pueden ser obtenidos en semanas y por doblamiento cromosómico un gran numero de diploides homocigoticos son obtenidos en una sola generación.
El cultivo de células haploides es también material útil en estudios de la genética de las células somáticas
            Los haploides pueden ser utilizados para obtener  homocigosis para genes en casos donde es normalmente difícil lograrlo (alelos autoincompatibles).
           La renuencia a la regeneración en muchas especies y los bajos rendimientos de plantas haploides son limitantes técnicas 



 Tecnica para duplicar el materia cromosomico

          Regeneración por métodos de cultivo de tejidos:
Las hojas maduras tienen el potencial de regenerar tanto plantas haploides como diploides, los diploides resultan de la endoreduplicacion  de cromosomas, lo que ocurre frecuentemente en tejidos cultivados in vitro
Doblaje inducido quimicamente con colchicina
El numero de cromosomas puede ser duplicado mediante la aplicacion de colchicina a los embriones o a las plantas haploides  (sumergiendo las anteras que contienen los proembriones en una solucion acuosa con 0.5% de colchicina durante 24 a 48 h)

Cultivo de embriones y Ovulos


Factores que afectan el cultivo de embriones


Genotipo
Condiciones de crecimiento de la planta
Composición del medio nutritivo:  Sales, sacarosa, 
                                                    extractos de plantas
Osmolaridad: depende del estado de dllo del embrión.
Luz  y Temperatura

Aplicaciones Practicas
  1. Eliminación de la inhibición total de la germinación de semillas viables
  2. Acortar el tiempo de mejora
  3. Germinación de semillas que requieren de parásitos obligados
  4. Prevención del aborto embrionario en frutales o por resultado de incompatibilidad.
5.  Propagación vegetativa de especies en general (Gramineas y Coniferas) y de especies raras (Musa balbisiana y cocos llamados makapunos)







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